分光光度計(jì)就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。該儀器是食品廠、飲用水廠辦理QS、HACCP認(rèn)證的*檢驗(yàn)設(shè)備。 分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。儀器分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成。 分光光度計(jì)計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計(jì)算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。 核酸的定量 核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。 事實(shí)上,分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即分光光度計(jì)有一定的準(zhǔn)確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時(shí),離子濃度太高,也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對較小,結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計(jì)的測試范圍)。zui后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡,空白液無 |
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分光光度計(jì)的特點(diǎn):
采用微機(jī)控制并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
□用干涉濾光片作為分光元件,光電管進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換。
□具有鉀、鈉濃度直讀,曲線擬合,靈敏度漂移,自動(dòng)校正,自動(dòng)調(diào)滿度?;鹧婺芰恐甘荆僮魇д`顯示,打印結(jié)果等功能。
□線性穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好,尤其適合臨床應(yīng)用。
分光光度計(jì)就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。該儀器是食品廠、飲用水廠辦理QS、HACCP認(rèn)證的*檢驗(yàn)設(shè)備。
分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。儀器分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成。
分光光度計(jì)計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計(jì)算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上,分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即分光光度計(jì)有一定的準(zhǔn)確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時(shí),離子濃度太高,也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對較小,結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計(jì)的測試范圍)。zui后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡,空白液無